velikol.ru
1

ТЕОРИЯ МЕМБРАННОГО ТРАНСПОРТА

Член-корреспондент АН СССР М. В. ВОЛЬКЕНШТЕЙН,

кандидат физико-математических наук С. Н. ФИШМАН

Подлинная биофизика — это физика явлений жизни. Исследование ста­новится биофизическим с того момента, когда сформулирована физиче­ская задача. Решение этой задачи может быть получено не только физи­ческими и физико-химическими, но в ряде случаев и чисто биологически­ми методами. Такова, например, работа Ф. Крика и сотрудников, впервые доказавшая триплетность и неперекрываемость генетического кода. На­против, применение физических или математических методов к решению биологической проблемы (скажем, области популяционной динамики или физиологии) еще не означает биофизического исследования. Дело не в ме­тодах, а именно в постановке задачи.

Физическая задача, относящаяся к явлениям жизни, ввиду их чрезвы­чайной сложности может быть сформулирована лишь в результате глубо­ких биологических и биохимических исследований. В сущности лишь не­многие области биологии находятся сейчас в таком состоянии, что физи­ки могут эффективно в них работать. Одна из этих областей — изу­чение биоэлектрических, мембранных явлений как в покоящихся, так и в возбужденных клетках. Эти явления давно стали предметом пристально­го внимания. Они принадлежат к наиболее старому и традиционному разделу биофизики — к биофизике клетки. Быстрое развитие молекуляр­ной биологии привело к созданию молекулярной биофизики. Сегодня уже «наведены мосты» между молекулярной биофизикой и биофизикой клетки и можно ставить задачу исследования молекулярного механизма основных мембранных явлений. В частности, нами предпринята попытка построить теоретическую молекулярную модель пассивного и активного транспорта ионов Na и К в биологических мембранах 1.

Известно, что между цитоплазмой большинства клеток и окружающей их средой существует разность потенциалов в 50—70 мв, причем внутрен­няя сторона клеточной мембраны имеет отрицательный заряд. Эта раз­ность потенциалов называется потенциалом покоя. С ним связаны наблю­даемые градиенты концентраций ионов Na и К. Внутри клетки концен­трация ионов К в 10—20 раз выше, чем снаружи. Для Na наблюдаются градиенты того же порядка, но противоположного направления. Такие гра­диенты могли бы объясняться специфическим связыванием ионов цито­плазмой. Однако опыты по измерению подвижности и активности ионов К и Na в цитоплазме показывают, что дело не в этом2. Предположение о спе­цифическом связывании непосредственно опровергается также прямыми опытами, в которых цитоплазма заменялась искусственной средой. Такая замена не приводит к уничтожению указанных градиентов 3.

1 См.: М. В. В о л ь к е н ш т е й н. С. Н. Ф и ш м а п. «Биофизика», 1969, т. 14, № 6;
1970, т. 15, № 1.

2 См.: Н. Н. Никольский. В кн. «Руководство по цитологии». Т. 1, М.— Л.,
изд-во «Наука», 1965; А. А. В е р е н и н о в, А. А. Лев. В кн. «Руководство по цито­
логии». Т. 2. М.— Л., изд-во «Наука», 1966.

3 См.: А. Ходжкин. Нервный импульс. М., изд-во «Мир», 1965; Б. К а т ц. Нерв,
мышца и синапс. М., изд-во «Мир», 1968; J. T a s a k i. Nerve Excitation. Springfield, Ch.
С. Thomas, 1967.

^ ТЕОРИЯ МЕМБРАННОЮ ТРАНСПОРТА

45






Остается думать, что потенциал покоя обусловлен неравновесным про­цессом диффузии ионов через мембрану. Еще в 1949 г. А. Ходжкин и Б. Катц вывели формулу для потенциала покоя, трактуемого как диффузи­онный потенциал 4. Выясняется, что потенциал покоя логарифмически за­висит от произведений концентраций диффундирующих ионов на соответ­ствующие коэффициенты проницаемости. Такая зависимость получается также на основе микроскопической теории диффузии ионов через мембра­ну 5. При этом несущественны конкретные предположения о механизме переноса ионов. Перенос может осуществляться в результате как обмена на неподвижных центрах («эстафетный» механизм), так и перемещения сквозь мембрану неких молекул, связывающих ионы (механизм «переносчика»).

Однако теория Ходжкина — Катца согласуется с опытом лишь в области больших концентраций ионов К в наружной среде или малых концентра­ций во внутренней. Коэффициенты проницае­мости оказываются не постоянными, а зависящими от концентраций ионов. Мы поставили перед со­бой задачу найти физическую модель, объясняю­щую эти зависимости.

Допустим, что в мембране имеется конечное число ионообменных центров. Тем самым мембра­на может быть насыщена ионами: если много ионов уже вошло в мембрану, вход последующих ионов затруднен. Реализуется своего рода «отри­цательная кооперативность». При этом можно представить себе два варианта механизма перено­са. Модель А: имеются два сорта обменных центров — одни связывают преимущественно К, другие — Na. Модель Б: все центры однотипны, и ионы К и Na конкурируют друг с другом в процессе ионного обмена. Будем предполагать, что движение ионов лимитируется на границе мембрана — раствор. Иными словами, движение ионов — это процесс, требующий энер­гии активации, особенно значительной на этой границе.

При таком приближении профиль потенциальной энергии иона, пере­секающего мембрану, представляется в виде двух максимумов на грани­цах мембраны и минимума между ними (рис. 1).

Мы рассчитали потоки в такой системе методом классической микро­скопической кинетики. Константы скоростей пересечения барьеров запи­саны на основе теории абсолютных скоростей реакций6. Через эти кон­станты потоки оказываются связанными с трансмембранным потенциалом.

При отсутствии электрического тока потоки Na+ и К+ должны компен­сировать друг друга. Приравнивая стационарные потоки Na+ и К+, можно получить соотношение между концентрациями этих ионов и величиной трансмембранного потенциала. Это выражение отличается от формулы Ходжкина — Катца тем, что вместо отношения постоянных коэффициентов проницаемости в него входит отношение величин, зависящих от концентра­ций: чем больше концентрация ионов в растворе, тем меньше становится соответствующий коэффициент проницаемости. Такой результат является естественным следствием принятой нами физической модели. Проницае-

4 См.: A. Hodgkin, В. Katz. «J. Physiol». London, 1949, v. 108, p. 37.

5 См.: R. P a r 1 i п. Н. Е у г i n g. Ion transport across membranes, N. Y., Acad. Press,
1954.

6 См.: С. Глесстон, К. Лейдлер, Г. Эйринг. Теория абсолютных скоростей
реакций. Изд-во пностр. лит., 1948.

46

^ М. В. ВОЛЬКЕНШТЕЙН, С. Н. ФИШМАН

мость должна быть пропорциональна числу свободных мест в мембране, доступных ионам. Когда полное число таких мест ограничено, число мест, уже занятых ионами, тем больше, чем больше концентрация ионов в омы­вающем растворе. Соответственно число свободных мест, а следовательно, и проницаемость уменьшаются с увеличением концентрации.

Надо обратить внимание на следующий факт. При рассмотрении моде­ли А, когда «каналы проницаемости» у Na+ и К+ различны, зависимости коэффициентов проницаемости этих ионов от концентраций описываются различными параметрами. В модели Б, когда ионы транспортируются по одним и тем же каналам, зависимости коэффициентов проницаемости от концентраций отличаются лишь постоянным множителем. Это приводит к тому, что отношение проницаемостей PNa : ^к в модели А остается завися­щим от концентраций, а в модели Б оно от концентраций не зависит.

В формулу для потенциала покоя входит именно отношение PNa: Рк. Поэтому модель Б, для которой это отношение постоянно, приводит к формуле для потенциала покоя, аналогичной формуле Ходжкина — Катца. Модель А дает отношение РNa: РК, зависящее от концентраций ионов, как это и наблюдается на опыте.

Зависимость PNa: Рк от концентраций приводит к тому, что связь меж­ду потенциалом покоя и концентрациями ионов не остается логарифмиче­ской, как в формуле Ходжкина — Катца. Потенциал покоя не увеличи­вается логарифмически до бесконечности, a стремится к некоторой пре­дельной величине в соответствии с опытом. Теория дает уравнения для этой предельной величины потенциала покоя. Численно решить это урав­нение мы не можем, так как в него входят два неизвестных в настоящее время параметра. Однако с помощью этого уравнения, воспользовавшись известной из опыта предельной величиной потенциала покоя, мы смогли оценить один из параметров: разность энергий К+ в растворе и в мем­бране должна быть больше, чем 3—4 ккал/молъ. Это разумный порядок величины для энергии связывания иона.

Таким образом, сравнение нашего теоретического исследования с опыт­ными данными позволяет дискриминировать два различных механизма переноса ионов в покоящейся мембране. Это сравнение говорит в пользу модели, предполагающей раздельные каналы для транспорта Na+ и К+.

Потенциал покоя рассмотрен нами как диффузионный потенциал. Что­бы он оставался неизменным, должен поддерживаться градиент электро­химического потенциала диффундирующих ионов. Ионы, находящиеся в состоянии электрохимического равновесия, не могут вносить вклад в диф­фузионный потенциал. Клеточная мембрана обладает способностью под­держивать постоянным градиент ионов Na+ и К+. Наряду с пассивными потоками этих ионов осуществляется активный их перенос через мебрану — в направлении, противоположном градиенту электрохимического по­тенциала. Активный транспорт увеличивает свободную энергию, поэтому он должен быть сопряжен с процессами, повышающими энтропию. Термо­динамическое сопряжение между векторным диффузионным потоком и скалярной химической реакцией невозможно — скалярная причина не мо­жет давать векторные следствия (принцип Кюри). Однако в стационарном состоянии открытой системы реализуется «косвенное сопряжение», опре­деляемое условиями непрерывности, и химические потенциалы транс­портируемых веществ оказываются связанными с метаболическим про­цессом.

Прямыми опытами с мечеными атомами установлено, что через клеточ­ные мембраны действительно осуществляется перенос ионов против гра­диента концентраций. Наличие таких активных потоков связано с содер­жанием АТФ в клетке. Как показали П. Колдуэлл, А. Ходжкин, Р. Кей-

^ ТЕОРИЯ МЕМБРАННОГО ТРАНСПОРТА

AT






нес и Т. Шоу7, увеличение концентрации АТФ в омывающем растворе не дает эффекта, а подача ее во внутренний раствор увеличивает активный перенос. Дж. Скоу8 выделил из мембран фермент, который ведет расщеп­ление АТФ в присутствии ионов Na+ и К+. Деятельность этой Na—К-активируемой АТФ-азы тесно связана с активным переносом ионов: ее, на­пример, ингибирует убаин в той же концентрации, в какой он прекращает работу Na — К-насоса. Это позволяет думать, что в соответствии с об­щими принципами биоэнергетики расщепление АТФ дает энергию, необхо­димую для активного переноса, гидролиз АТФ является той реакцией, которая сопря­жена с активным транспортом.

Обобщая имеющиеся экспериментальные данные, Л. Опит и Дж. Чарнок предложили молекулярную модель Na — К-насоса 9, но ма­тематически ее не исследовали. Феноменоло­гическая теория, основанная на термодина­мике неравновесных процессов, предложена в работе А. Качальского и Р. Спанглера 10. Однако до сих пор не было молекулярной теории активного транспорта и не рас­смотрены многие наблюдаемые на опыте яв­ления.

Экспериментальное изучение выходящего из клетки активного потока натрия показало, что эта величина зависит от внутриклеточ­ной концентрации Na и концентрации К в омывающем растворе. Зависимость эта имеет S-образный характер11. Чтобы понять природу явления, мы провели кинетический анализ процес­са активного переноса.

Будем исходить из уже описанной модели А, но предположим, что и для Na+ и для К+ имеются два типа ионообменных центров: одни, связан­ные с фосфолипидной частью мембраны и неспецифическими белками, способствуют осуществлению пассивного переноса, другие располагаются на белке-ферменте и обеспечивают активный транспорт. Перемещение ионов идет по эстафетному механизму.

На ферменте происходит расщепление некоторого вещества X (пред­положительно АТФ) на продукты У и Z (АДФ и фосфат). Одновременно ион К+, связанный с ионообменным центром фермента, заменяется на комплекс иона Na+ и продукта Y. Комплекс NaY перемещается по градиен ту концентрации к наружной поверхности, где при участии ионов К+ рас­падается на Na+ и Y и отрывается от ионообменного центра.

Нами составлена система уравнений, описывающая кинетику этих ре­акций. Считая ферментативные реакции необратимыми, можно решить эту систему и проанализировать зависимость величины активного потока ионов Na+ от концентрации Na+ внутри клетки и от концентрации К+ в окружающей среде. Эта зависимость описывается гладкой кривой с на­сыщением, если стехиометрические коэффициенты в реакциях равны 1 (рис. 2а). Если же эти коэффициенты не равны 1, кривая имеет один

7 P. Caldwell, A. Hodgkin, R. Keynes, Т. Shaw. «J. Physiol.» (London),
1960, v. 152, p. 561.

8 J. S k о u. «Biochim. Biophys. Acta», 1957, v. 23, p. 394.

9 L. О pit, ,T. Char nock. «Nature», 1965, v. 208, p. 471.

10 А. К a t с h a 1 s k y, R. Spangler. «Quart. Rev. Biophys.», 1968, v. 1, p. 127.

111 См.: Г. И. Романенко, С. В. Айрапетянц, Я. М. А б р а м е н к о. «Цито­
логия», 1967, № 6, стр. 1354; Е. Harris. «J. Physiol.» (London), 1965, v. 177, p. 355;
P. H о г о w i с z, C. G e r b e r. «J. Gen. Physiol», 1965, v. 48, p. 489.

48

^ М. В. ВОЛЬКЕНШТЕЙНН, С. Н. ФИШМАН

перегиб (рис. 26). Опыт дает именно такие S-образные кривые 12. Это значит, что в реакциях, связанных с активным транспортом, происходит одновременный обмен нескольких ионов К+ на несколько ионов Na+. Про­цесс активного транспорта определяется кооперативным обменом ионами на внутренней и наружной поверхности мембраны. По углу наклона кри­вой в точке перегиба можно оценить число «кооперирующих» ионов п. Сравнение с опытом 13 дает п порядка 3, что согласуется с данными других авторов, полученными независимыми способами.

Таким образом, теоретическое исследование мембранного транспорта, основанное на простых представлениях молекулярной физики, действи­тельно объясняет важные особенности этого явления.

Липопротеидная система мембраны — система ферментативная. Это относится как к мембранам нервных аксонов, так и к «биоэнергетическим» мембранам митохондрий, в которых происходит окислительное фосфори-лирование. Основой физики ферментативного катализа являются конфор-мационные свойства макромолекул белка, а не специфические электрон­ные явления, определяемые более чем сомнительной полупроводимостью белка14. Но конформационные свойства белков, ферментативная актив­ность регулируются электронными свойствами кофакторов, в частности ионов металлов 15. Именно с такой регуляцией АТФ-азы ионами щелоч­ных металлов мы встречаемся в явлениях активного мембранного транс­порта. Как видим, эти явления имеют кооперативный характер.

Кооперативные свойства мембран еще недостаточно изучены. Не под­лежит сомнению, что ряд важнейших биологических явлений, связанных с мембранами, определяется именно кооперативным поведением двухмер­ной упорядоченной мембранной системы. Действие малых количеств фар­макологических веществ на клетку, умерщвление бактерий Е. coli колхи­цином происходят, по-видимому, в результате конформационного превра­щения в клеточной мембране в целом, подобного фазовому переходу. Пер­вые попытки создания теории этих явлений16 исходят из современных представлений о кооперативных свойствах аллостерических ферментов 17. С другой стороны, периодические процессы в мембранах также, несомнен­но, определяются их кооперативными свойствами 18. Дальнейшее развитие теории кооперативных двухмерных систем — мембран — требует примене­ния современных методов статистической физики, основанных на трактов­ке так называемой модели Изинга 19, не столько к рассмотрению термоди­намических, сколько к исследованию кинетических свойств мембран.

Переходя от молекулярной биофизики к биофизике клетки, мы прежде всего встречаемся с упорядоченными надмолекулярными структурами мембран — структурами, без которых нет жизни на клеточном уровне. Изучение мембран должно в свою очередь дать очень много молекулярной биофизике, в частности физике ферментов.

12 См.: Г. И. Романенко, С. В. Айрапетянц, Я. М. Абраменко. «Цито­
логия, 1967, № 6, стр. 1354; Е. Harris. «J. Physiol.» (London), 1965, v. 177, p. 355;
P. Horowicz, G. Gerber. «J. Gen. Physiol.», 1965, v. 48, p. 489.

13 См.: Г. И. Романенко, С. В. Айрапетянц, Я. М. Абраменко. «Цито­
логия», 1967, № 6, стр. 1354.

14 См.: М. В. Волькенштейн. Физика ферментов. М., изд-во «Наука», 1967.

15 См.: М. В. Волькенштейн. «Биофизика», 1970, т. 15, № 2.

16 См.: J. P. Changeux, J. Thiery, Y. Tung, С. Kittel. «Proc. Nat. Acad.
USA», 1967, v. 57, p. 334; J. P. С n an g e u x, J. T hi e ry. «J. Theoret. Biol.», 1967, v. 17,
p. 315.

17 См.: М. В. Волькенштейн. Физика ферментов. М., изд-во «Наука», 1967.

18 См.: A. Katchalsky, R. Spangle r. «Quart. Rev. Biophys.», 1968, v. 1, p. 127.

19 См.: М. В. Волькенштейн. Молекулы и жизнь. М., изд-во «Наука», 1965.

УДК 591.047